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一、目的要求

1、掌握多克隆抗體的制備原理；

2、熟悉多克隆抗體的制備過程

3、了解多克隆抗體效價的鑒定與判斷方法

二、原理

抗原分子通常具有多個抗原表位，用抗原免疫動物后，可激發(fā)多種具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答。由活化的B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞分泌抗體進(jìn)入血液，從血清中分離出多種針對不同抗原表位抗體的混合物即為多克隆抗體(polyclonal antibody,pAb),也稱免疫血清或抗血清。

   高效價抗血清的獲取，主要取決于抗原的純度、免疫原性及免疫程序（如免疫途徑、抗原劑量、注射次數(shù)與周期等）。為提高抗原的免疫原性，可在免疫動物時加用佐劑。常用的是弗氏佐劑包括弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑兩種。

三、材料

1、純化的人免疫球蛋白IgG。

2、生理鹽水或PBS。

3、弗氏完全及不完全佐劑（可自行制作或購買成品）。

4、健康成年兔，雄雌不限，體重1.5～2.5kg。

5、Eppendorf、金屬鑷子、無菌注射器及6號與9號注射針頭。

6、動物固定架，手術(shù)器械。

7、酒精棉球及碘氟等。

四、方法

1、按150～200微克/公斤體重稱取人免疫球蛋白Ig溶于0.5ml生理鹽水進(jìn)行計算。置于適當(dāng)容器中進(jìn)行溶解。

2、逐滴加入等體積的弗氏完全佐劑，用裝有9號注射針頭的注射器反復(fù)抽吸進(jìn)行乳化，直至取1滴放在冰水面上，不散開即為形成了乳化劑。

3、將體重適宜的健康家兔，用剪刀剪去頸背部及后腳掌的毛發(fā)，固定好。用碘

氟、酒精消毒皮膚。

4、用2ml的注射器吸取抗原溶液1ml,于兔頸背部及后腳掌皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.1～0.2ml。

5、間隔2周重復(fù)免疫，抗原的劑量及注射部位同上，應(yīng)用弗氏不完全佐劑進(jìn)行

乳化。免疫3～4次。

6、末次免疫，可經(jīng)靜脈注射不加佐劑的抗原溶液，劑量為首次免疫的50～60%。

7、免疫血清的效價測定：末次免疫后10天左右，從耳緣靜脈取血少許，4℃放置4小時以上，以2000r/min離心10分鐘，收獲血清。采用免疫雙擴(kuò)散方法測定抗體的效價。

8、經(jīng)測定，如抗體效價達(dá)到要求（一般為1:16以上），采用頸動脈放血法收集血液（應(yīng)無菌操作），待其凝固后離心收獲血清。

五、注意事項(xiàng)

1、抗原乳化劑的制備、動物免疫及收獲血清等實(shí)驗(yàn)過程中均應(yīng)注意無菌操作。

2、動物免疫的抗原用量及免疫次數(shù)因抗原的性質(zhì)及不同的動物種類而異。一般免疫3～4次。

3、如經(jīng)鑒定，抗體效價較低，可再免疫1～2次后收獲免疫血清。

六、思考題

1、免疫動物的途徑大多采用皮下注射，為什么？

2、制備可溶性抗原的溶液時，加用免疫佐劑的目的是什么？

附：免疫血清的保存方法

    為了減慢抗體效價降低的速度，免疫血清一般采取無菌、低溫、高濃度及加防腐劑的方法保存。收獲的免疫血清應(yīng)立即進(jìn)行分裝后-80℃冷凍保存。視具體情況（如免疫血清僅用于體外的實(shí)驗(yàn)研究），可加入0.01～0.02%的疊氮鈉（NaN₃）作為防腐劑。保存過程中盡可能減少凍溶的次數(shù)，以免抗體變性，效價降低。