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產(chǎn)品說(shuō)明

 

     小 G 蛋白是從屬于細(xì)胞調(diào)節(jié)因子中的一個(gè)超家族。Rho 家族是小 G 蛋白中的一個(gè)亞家族，它在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的 RhoA 就屬于Rho 亞家族中的一種， RhoA 參與生理活動(dòng)過(guò)程中其分子結(jié)構(gòu)會(huì)呈現(xiàn)出 2 種相互轉(zhuǎn)換的形式：與 GTP 結(jié)合的激活狀態(tài)和與 GDP 結(jié)合的非活性狀態(tài)。 

目前RhoA蛋白活性的檢測(cè)主要是依據(jù)小GTP酶RhoA可以與RhoA效應(yīng)蛋白(Rhotekin)的 RBD 區(qū)域結(jié)合，使 RhoA 效應(yīng)蛋白活化從而發(fā)揮生物學(xué)功能，進(jìn)而間接的進(jìn)行 RhoA 活性功能的監(jiān)測(cè)。然而此方法在檢測(cè)過(guò)程中存在著一定的局限性比如 GTP 水解成 GDP 的速度過(guò)快以及 RhoA-GTP 結(jié)合蛋白與 RBD 結(jié)合區(qū)域之間較低的親和力，導(dǎo)致這種檢測(cè)方法的重復(fù)性較差。

         而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的 RhoA 活性檢測(cè)試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識(shí)別特殊構(gòu)象的 RhoA-GTP 結(jié)合蛋白，而不識(shí)別 RhoA-GDP 結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡(jiǎn)單并且快速的進(jìn)行 RhoA 的活性檢測(cè)。同時(shí)試劑盒中的 RhoA-GTP 單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中 RhoA 的活性監(jiān)測(cè)。每套試劑盒可以進(jìn)行 30 次檢測(cè).

 

檢測(cè)原理

 

    武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RhoA 活性檢測(cè)試劑盒主要是利用識(shí)別蛋白特異構(gòu)象的 RhoA-GTP 單克隆抗體特異性的去檢測(cè)細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行 GTPγS 活化處理）活性 RhoA-GTP 的水平。簡(jiǎn)言之，特異性識(shí)別 RhoA 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的 RhoA-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來(lái)，再利用特異性識(shí)別 RhoA 的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測(cè)。

 

試劑盒組份及儲(chǔ)存

名稱(chēng)	貨號(hào)	規(guī)格	儲(chǔ)存溫度
Anti-active Rhoa mouse Monoclonal antibody	Cat.#26904	1x35ul	-20℃
Protein A/G Agarose	Cat.#30301	1x600ul	4℃
5xAssay/ lYsis Buffer	Cat.#30303	1x30ml	4℃
Anti-Rhoa Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#21017	1x50ul	-20℃
100xGTP-rS	Cat.#30302	1x50ul	-80℃
100XGDP	Cat.#30304	1x50ul	-80℃
HRP-Goat anti-Rabbit IgG	Cat.#29002	1x50ul	-20℃

 

注意:使用前應(yīng)將100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復(fù)凍融。

 

試劑盒所需自備物品。

 

1.刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測(cè)試劑；

 

試劑盒注意事項(xiàng)

 

1.收到試劑盒后如不立即使用，請(qǐng)將試劑盒組分按照標(biāo)簽說(shuō)明存儲(chǔ)在相應(yīng)的溫度，100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復(fù)凍融。 

2.Protein A/G Agarose使用前請(qǐng)稍微離心甩一下，因管壁上可能殘留，而且是用20%乙醇保存的，如果乙醇揮發(fā)，體積較少時(shí)很難將Agarose吹散，所以請(qǐng)補(bǔ)充20%乙醇等于A(yíng)garose的體積。

3.. 使用50% 的Protein A/G Agarose前先用槍將其吹勻，一個(gè)反應(yīng)管使用20 ul的50% 的Protein A/G Agarose足夠。

4. 將50% 的Protein A/G Agarose加入反應(yīng)管前先用1×Assay/Lysis Buffer洗滌3遍，以去除其中的乙醇，最后一遍用合適體積的1×Assay/Lysis Buffer懸浮Agarose，再分裝于 反應(yīng)管，保證每管參與反應(yīng)的50% 的Protein A/G Agarose有20 ul。

5. 為了減少50% 的Protein A/G Agarose的損失，可以先在反應(yīng)管中加入適當(dāng)體積的1×Assay/Lysis Buffer。

6. 反應(yīng)管中試劑加入順序建議，先1×Assay/Lysis Buffer，然后是用Buffer稀釋的Protein A/G Agarose，細(xì)胞裂解液和活性抗體，總體積建議0.5ml-1ml

7. 活性抗體的加入量請(qǐng)適當(dāng)做調(diào)整，如可以加入0.5ug、1ug或者2ug。

8. 孵育反應(yīng)在4℃ 360度搖床進(jìn)行。

9. 反應(yīng)完畢，洗滌Agarose時(shí)候，盡量避免吸走Agarose。

 

 實(shí)驗(yàn)操作步驟

 

A  試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實(shí)驗(yàn)前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 B  樣品處理

 貼壁細(xì)胞

1.培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個(gè)細(xì)胞），并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理.

2.吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3.  向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

4.  將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5.  用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來(lái)。

6.  將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7.  如果核發(fā)生裂解,細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí),將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來(lái)回吸取3-4次，以破壞基 因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8.  4度12000g, 離心 10 min。

9.  收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

懸浮細(xì)胞

1.培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 計(jì)數(shù)細(xì)胞后離心。

3.吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

5.反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。

6.將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來(lái)回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

8.4°C 12000 g, 離心10min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽(yáng)性和陰性的對(duì)照(可選）

 

注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的 RhoA 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 RhoA 被激活。 

1. 準(zhǔn)備兩個(gè)離心管，每個(gè)管中各加入 0.5 mL 的細(xì)胞提取物（如果是純的RhoA蛋白則每個(gè)管中加入的蛋白量為1ug）。

2. 每個(gè)管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個(gè)管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽(yáng)性對(duì)照。另一個(gè)管中加入5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對(duì)照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動(dòng)。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D. 激活 RhoA 的親和沉淀

 

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個(gè)樣品的總體積調(diào)整到1ml 

3. 向管中加入 1ul 的活性 RhoA 單克隆抗體。(Cat.# 26904)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時(shí)，并輕輕的進(jìn)行搖動(dòng)。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說(shuō)明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時(shí)進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA Anti-RhoApAb(Cat.#21009),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 RhoA 蛋 的量）室溫下孵育 1-2 小時(shí)，或者 4°C 條件下過(guò)夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時(shí)并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測(cè)方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。

 

 示例結(jié)果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RhoA 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。 

 

Rho 活性分析。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）用血小板衍生因子（PDGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細(xì)胞裂解物用特異性識(shí)別 RhoA 活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體(Cat#26904)孵育(上圖)。親和沉淀物用anti-RhoA pAb(Cat#21009)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。底部的圖展示的是細(xì)胞裂解液的活性RhoA 的 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 

         

        與傳統(tǒng)的 GST- pull down 方法相比，該試劑盒具有以下明顯優(yōu)勢(shì)

 

1.    靈敏度高；誘導(dǎo)蛋白與目標(biāo)蛋白中的結(jié)合對(duì)蛋白量的要求比較高。而抗體與蛋白的結(jié)合對(duì)樣本中蛋白的要求比較少。

2. 特異性強(qiáng)；因?yàn)檎T餌蛋白是需要加上GST標(biāo)簽的重組蛋白，所以是非生理狀態(tài)下的驗(yàn)證，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和形式可能與天然狀態(tài)下存在一定差異，而抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合 ，活細(xì)胞狀態(tài)下蛋白質(zhì)之間的相互作用被保持，所以其反映的是細(xì)胞中真實(shí)的蛋白情況.

3. 應(yīng)用更為廣泛；試劑盒中能夠特異性識(shí)別GTP結(jié)合狀態(tài)的三聚體G蛋白或者小G蛋白的單克隆抗體，適應(yīng)各種種屬（Human，Mouse，Rat，Rice plants，Pig Cotton，bacteria，Escherichia coli等）應(yīng)用范圍非常廣泛（ IP ,WB ,IHC IF ICF,ICC,IHF.FC,Elisa 等）隨著這些應(yīng)用的普及，G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究進(jìn)展，必將進(jìn)一步加快。

 

 

 

 

 

 

 

示例結(jié)果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RhoA 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。 

 

 

 

 

Rho 活性分析。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）用血小板衍生因子（PDGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細(xì)胞裂解物用特異性識(shí)別 RhoA 活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26904)孵育(上圖)。親和沉淀物用anti-RhoA pAb(Cat # 21009)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。底部的圖展示的是細(xì)胞裂解液的活性 RhoA 的 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。