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PRODUCT CENTER
價格 | ¥6800.00 |
品牌 | NewEast Biosciences |
產地 | 中國 武漢 |
貨號 | 80701 |
規(guī)格 | 30 Assays |
說明書 | 說明書下載 |
Cdc42 Pulldown Activation Assay Kit
Catalog Number:80701
30 assay
產品說明
小G蛋白是從屬于細胞調節(jié)因子中的一個超家族。Rho家族是小G蛋白中的一個亞家族,它在細胞運動、細胞分裂以及基因轉錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的Cdc42就屬于Rho亞家族中的一種, Cdc42參與生理活動過程中其分子結構會呈現(xiàn)出2種相互轉換的形式:與GTP結合的激活狀態(tài)和與GDP結合的非活性狀態(tài)。
目前Cdc42蛋白活性的檢測主要是依據(jù)小GTP酶Cdc42可以與p21活化激酶(PAK)的p21結合區(qū)域(PBD)結合,使PAK活化從而發(fā)揮生物學功能,進而間接的進行Cdc42活性功能的監(jiān)測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度過快以及Cdc42-GTP結合蛋白與p21結合區(qū)域之間較低的親和力,導致這種檢測方法的重復性較差。
紐斯特生物技術有限公司推出的Cdc42活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別Cdc42-GTP結合蛋白,而不識別Cdc42-GDP結合蛋白,進而簡單并且快速的進行Cdc42的活性檢測。同時試劑盒中的Cdc42-GTP單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中Cdc42的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進行30次檢測。
檢測原理
武漢紐斯特生物技術有限公司的Cdc42活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異形態(tài)的Cdc42-GTP單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的(樣品需要進行GTPγS活化處理)活性Cdc42-GTP的水平。簡言之,特異性識別Cdc42活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結合細胞裂解液中的Cdc42-GTP活性蛋白,然后利用Protein A/G將抗原抗體的結合物吸附下來,再利用識別Cdc42 兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。
試劑盒組分及儲存
名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 儲存溫度 |
Anti-active Cdc42 mouse Monoclonal antibody |
Cat.#26905 | 1x35ul | -20℃ |
Protein A/G Agarose | Cat.#30301 | 1x600ul | 4℃ |
5xAssay/ lYsis Buffer | Cat.#30303 | 1x30ml | 4℃ |
Anti-Cdc42 Rabbit polyclonal antiboy | Cat.#21010 | 1x50ul | -20℃ |
100xGTP-rS | Cat.#30302 | 1x50ul | -80℃ |
100XGDP | Cat.#30304 | 1x50ul | -80℃ |
HRP-Goat anti-Rabbit IgG | Cat.#29002 | 1x50ul | -20℃ |
注意:使用前應將100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管,并立即放入 -80℃ 凍存,避免反復凍融。
試劑盒所需自備物品
1.刺激和未刺激的細胞裂解物;
2. 蛋白酶抑制劑;
3. 4 °C 搖桿或者搖床;
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0);
5. 1 M MgCl2;
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer;
7. 電泳和免疫印跡相關試劑;
8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20);
9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA);
10 ECL 檢測試劑;
實驗操作步驟
A 試劑制備
1X Assay/Lysis Buffer:實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液,并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin(亮肽素),或 10 µg/mLaprotinin(抑肽酶)。
B 樣品處理
貼壁細胞
1. 培養(yǎng)細胞密度達到大約 80%-90%之間(直徑 10 cm 培養(yǎng)皿,~107個細胞),并用活性劑或抑制劑進行處理。
2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
3. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液(每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL)。
4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。
5. 用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。
6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解,細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時,將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次,以破壞基因 組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清(~1-2 mg 總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
懸浮細胞
1. 培養(yǎng)細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。
2. 計數(shù)細胞后離心。
3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
4. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液(每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL)。
5. 反復吹打細胞進行裂解。
6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解,細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時,
將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次,以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清(~1-2 mg 總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選)
注意:在細胞體內環(huán)境條件下大約有 10%的 Cdc42 被激活,而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Cdc42 被激活。
1. 準備兩個離心管,每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物(如果是純的 Cdc42 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug)。
2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。
3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS(終濃度即為 100 uM)作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP(終濃度即為 1 mM)作為陰性對照。
4. 將離心管置于 30°C 條件下反應 30 min 并不斷攪動。
5. 終止反應:將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。
D. 激活Cdc42的親和沉淀
1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。
2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。將每個樣品中的體積調整到1mL
3. 向管中加入 1ul 的活性 Cdc42 單克隆抗體。(Cat.# 26905)
4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻,
5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。
6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時,并輕輕的進行搖動。
7. 5000g,離心 1 分鐘。
8. 棄上清,這一步要非常小心以避免珠子的損失。
9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次,離心并棄去上清。
10. 最后一次洗滌后,小心的移去所有的上清。
11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。
12. 樣品煮沸 5min。
13. 5000g,離心 10s。
E. 蛋白印跡實驗
1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。
2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。
3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉到 PVDF 或硝化纖維素膜。
4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s,然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意:如果使用的是硝化纖維 素膜,此步省略。
5. 封閉; 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉,并需要恒定振蕩。
6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
7. 孵育一抗:用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Cdc42 pAb(Cat.# 21010),稀釋比例為 1:50-1:1000,主要根據(jù)樣品中含有的Cdc42 蛋 白的量)室溫下孵育 1-2 小時,或者 4°C 條件下過夜孵育.
8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
5. 孵育二抗:(例如羊抗兔 IgG-HRP)用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用,室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。
6. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
7. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。
示例結果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的Cdc42活性試劑盒的典型結果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。
Cdc42活性分析。小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)用表皮細胞因子(EGF)處理(Lane 2)和未處理(Lane 1)。細胞裂解物用特異性識別Cdc42活性構象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26905)孵育(上圖)。親和沉淀物用 Anti-Cdc42 pAb(Cat # 21010)進行免疫印跡實驗。底部的圖展示的是細胞裂解液的活性Cdc42的Western blot實驗結果。(底圖SDS-PAGE的上樣量是上圖SDS-PAGE上樣量的5%。)
Related Products | |||
Catalog# | Name | Size | Price |
80701 | Cdc42 Activation Assay Kit | 30 assays | ¥6800 |
26905 | Active Cdc42-GTP Monoclonal Antibody | 30 μL | ¥4800 |
26008 | Anti-Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody | 100 μL | ¥1600 |
21010 | Anti-Cdc42 Rabbit Polyclonal Antibody | 100 μL | ¥1600 |
示例結果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的Cdc42活性試劑盒的典型結果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。
Cdc42活性分析。小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)用表皮細胞因子(EGF)處理(Lane 2)和未處理(Lane 1)。細胞裂解物用特異性識別Cdc42活性構象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26905)孵育(上圖)。親和沉淀物用 Anti-Cdc42 pAb(Cat # 21010)進行免疫印跡實驗。底部的圖展示的是細胞裂解液的活性Cdc42的Western blot實驗結果。(底圖SDS-PAGE的上樣量是上圖SDS-PAGE上樣量的5%。)
發(fā)表時間:2020年
名稱/貨號:Anti- Active Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody/ 26905
影響因子:Cell Mol Immunol IF=24.1
應用范圍:IP
種屬:Mouse
發(fā)表時間:2020年
名稱/貨號:Anti- Active Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody /26905
影響因子:Cell IF=64.5
應用范圍:IF
種屬:Mouse Human
發(fā)表時間:2021年
名稱/貨號:Anti- Active Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody /26905
影響因子:Int J Biol Sci IF=9.2
應用范圍:IP IHC
種屬:Human
發(fā)表時間:2022年
名稱/貨號:http://fjmgqqt.cn/ActiveAntibody/342/26905
影響因子:J Exp Clin Cancer Res IF=12.658
應用范圍:IP
種屬:Mouse
發(fā)表時間:2018年
名稱/貨號:Anti- Active Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody/26905
影響因子:Toxicological Sciences IF=3.564
應用范圍:FC
種屬:Mouse
發(fā)表時間:2017年
名稱/貨號:Anti- Active Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody/26905
影響因子:Human Molecular Genetics IF=4.544
應用范圍:IF
種屬:Human
發(fā)表時間:2019年
名稱/貨號:Anti- Active Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody/ 26905
影響因子:Aging-US IF=4.831
應用范圍:IF
種屬:Human
發(fā)表時間:2019年
名稱/貨號:Anti- Active Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody/ 26905
影響因子:Faseb Journal IF=4.966
應用范圍:IP
種屬:Mouse
發(fā)表時間:2017年
名稱/貨號:Cdc42 Pulldown Activation Assay Kit /80701
影響因子:Plos Genetics IF=5.174
應用范圍:IP-WB
種屬:Mouse
發(fā)表時間:2021年
名稱/貨號:Anti- Active Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody/ 26905
影響因子:Communications Biology IF=6.286
應用范圍:IP
種屬:Human
發(fā)表時間:2021年
名稱/貨號:Anti- Active Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody /26905
影響因子:International Journal of Biological Sciences IF=6.58
應用范圍:IP
種屬:Human
發(fā)表時間:2017年
名稱/貨號:Anti- Active Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody/ 26905
影響因子:Cell Stem Cell IF=21.464
應用范圍:IP
種屬:Mouse
發(fā)表時間:2018年
名稱/貨號:Cdc42 Pulldown Activation Assay Kit /80701
影響因子:Nature Medicine IF=36.13
應用范圍:IP-WB
種屬:Human