AAAAA少妇高潮大片,亚洲午夜无码久久久久,色综合99久久久无码国产精品,久久久精品国产免大香伊

武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司歡迎您!

手機(jī)店鋪

neweastbio@126.com

logo

 | 027-87561033

產(chǎn)品中心

PRODUCT CENTER

Gα13 Pulldown Activation Assay Kit

價格¥6800.00
品牌NewEast Biosciences    
產(chǎn)地中國 武漢
貨號80401
規(guī)格30 Assays
說明書說明書下載
  • 產(chǎn)品描述
  • 產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)圖文
  • 通路和蛋白
  • 技術(shù)資料
  • 文獻(xiàn)引用
掃一掃購買

  • Gα13 Pulldown Activation Assay Kit

    Catalog Number80401
    30 assays

     

    產(chǎn)品說明

             

        從光子到大肽,結(jié)構(gòu)多樣化的配體激活GPCRs他們的生理功能。配體結(jié)合的GPCRs,反過來,作為鳥嘌呤核苷酸交換在Gβγ存在下,Gα亞基上的GDP與GTP交換的催化因子,導(dǎo)致Gα亞基從Gβγ二聚體解離,形成兩個功能單元(Gα和Gβγ)。Gα和Gβγ亞基都向不同的細(xì)胞信號通路傳遞信號。根據(jù)序列在功能同源性方面,G蛋白分為4個家族:Gs、Gi、Gq G12。增加這些G蛋白的效應(yīng)物和相互作用蛋白的數(shù)量已經(jīng)被鑒定,生理上G蛋白參與的過程是增殖。在G蛋白的四個亞家族中,對G12/13亞家族的功能了解較少。在這個家族有兩個成員,G12和G13,它們無處不在地表達(dá) Gα12基因敲除小鼠出現(xiàn)正常。Gα13敲除小鼠表現(xiàn)出胚胎致死率(~E9.5)。G 13α- /鼠標(biāo)胚胎的維管系統(tǒng)有缺陷。G13也是酪氨酸激酶受體所必需的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。

            

            而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的 Gα13活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構(gòu)象的Gα13 GTP 結(jié)合蛋白,而不識別Gα13 GDP結(jié)合蛋白,進(jìn)而簡單并且快速的進(jìn)行Gα13 的活性檢測。同時試劑盒中的Gα13 GTP 單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中Gα13的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進(jìn)行 30 次檢測。

     

    檢測原理

        

       武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Gα13 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構(gòu)象的Gα13 GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細(xì)胞提取物或者體外的(樣品需要進(jìn)行 GTPγS 活化處理)活性Gα13 GTP 的水平。簡言之,特異性識別Gα13 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的Gα13 GTP 活性蛋白,然后利用 Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來,再利用識別Gα13的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測

     

    試劑盒組份及保存

     

    image.png

     

     

    試劑盒所需自備物品

     

    1. 刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物;

    2. 蛋白酶抑制劑;

    3. 4 °C 搖桿或者搖床;

    4. 0.5 M EDTA (pH 8.0);

    5. 1 M MgCl2;

    6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer;

    7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑;

    8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20);

    9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA);

    10 ECL 檢測試劑;

     

    實(shí)驗(yàn)操作步驟

     

    A  試劑制備

    1X Assay/Lysis Buffer:實(shí)驗(yàn)前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液,并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin(亮肽素),或 10 µg/mLaprotinin(抑肽酶)。 

     

    B  樣品處理

      貼壁細(xì)胞

    1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間(直徑 10 cm 培養(yǎng)皿,~107個細(xì)胞),并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理。

    2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

    3. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液(每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL)。

    4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

    5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

    6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

    7. 如果核發(fā)生裂解,細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時,將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次,以破壞基因    組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。

    8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

    9. 收集上清(~1-2 mg 總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

    懸浮細(xì)胞

    1. 培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。

    2. 計數(shù)細(xì)胞后離心。

    3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

    4. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液(每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL)。

    5. 反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。

    6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

    7. 如果核發(fā)生裂解,細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時,

      將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次,以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

    8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

    9. 收集上清(~1-2 mg 總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

     

    C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選)

     

    注意:在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的Gα13被激活,而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的Gα13 被激活。 

     

    1. 準(zhǔn)備兩個離心管,每個管中各加入 0.5 mL 的細(xì)胞提取物(如果是純的Gα13蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug)。

    2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

    3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS(終濃度即為 100 uM)作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP(終濃度即為 1 mM)作為陰性對照。

    4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動。

    5. 終止反應(yīng):將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

     

    D. 激活Gα13的親和沉淀

     

    1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

    2. 用 1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的總體積調(diào)整到1ml

    3. 向管中加入 1ul 的活性Gα13 單克隆抗體。(Cat.# 26902)

    4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻,

    5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

    6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時,并輕輕的進(jìn)行搖動。

    7. 5000g,離心 1 分鐘。

    8. 棄上清,這一步要非常小心以避免珠子的損失。

    9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次,離心并棄去上清。

    10. 最后一次洗滌后,小心的移去所有的上清。

    11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

    12. 樣品煮沸 5min。 

    13. 5000g,離心 10s。

     

    E. 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 

    1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

    2. 按照制造商的說明進(jìn)行 SDS-PAGE。

    3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

    4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s,然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意:如果使用的是硝化纖維 素膜,此步省略。 

    5. 封閉; 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進(jìn)行封閉,并需要恒定振蕩。 

    6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

    7. 孵育一抗:用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Gα13 pAb(Cat.# 21005),稀釋比例為 1:50-1:1000,主要根據(jù)樣品中含有的Gα13 蛋    白的量)室溫下孵育 1-2 小時,或者 4°C 條件下過夜孵育.

    8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

    9. 孵育二抗:(例如羊抗兔 IgG-HRP)用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用,室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

    10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

    11. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。

     

    示例結(jié)果

     

    下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Gα13活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

     

     

              image.png

     

    Gα13活性分析

     

    MEF細(xì)胞用LPA處理 (lane 2) 或 不用LPA處理(lane 1)用抗活性的Gα13進(jìn)行免疫沉淀(Cat.No.26902).用anti-Gα13 rabbit polyclonal antibody(Cat.No. 21005). 做免疫印跡分析。

     底部圖片;上圖細(xì)胞裂解液的5%用anti-Gα13 rabbit polyclonal antibody(Cat.No. 21005).做免疫印跡,作為一個參照。

     

     

       

     

    Related Products
    Catalog# Name Size Price
    80401 13 Activation Assay Kit  30 assays  ¥6800  
    26902 Active Gα13 GTP Monoclonal Antibody  30 μL  ¥4800
    26004 Anti Gα13 Mouse Monoclonal Antibody  100 μL  ¥2800
    21005 Anti Gα13 Rabbit Polyclonal Antibody  100 μL  ¥2600

     

    Publications:
    1.  Identification of novel signalling roles and targets for Galpha and Gbetagamma downstream of the insulin-like growth factor 1 receptor in vascular smooth muscle cells
        Biochem J. 2013 Feb 15;450(1):209-19
    2.  CRH activation of different signaling pathways results in differential calcium signaling in human pregnant myometrium before and during labor
        J Clin Endocrinol Metab. 2012 Oct;97(10):E1851-61
    3.  CXCR4 activation defines a new subgroup of Sonic hedgehog-driven medulloblastoma
        Cancer Res. 2012 Jan 1;72(1):122-32
    4.  Regulation of estradiol and progesterone production by CRH-R1 and -R2 is through divergent signaling pathways in cultured human placental trophoblasts
        Endocrinology. 2012 Oct;153(10):4918-28
    5.  WNT-5A stimulates the GDP/GTP exchange at pertussis toxin-sensitive heterotrimeric G proteins
        Cell Signal. 2011 Mar;23(3):550-4
    6.  Heterotrimeric Galpha(i) proteins are regulated by lipopolysaccharide and are anti-inflammatory in endotoxemia and polymicrobial sepsis
        Biochim Biophys Acta. 2011 Mar;1813(3):466-72
    7.  Estrogen- and xenoestrogen-induced ERK signaling in pituitary tumor cells involves estrogen receptor-α interactions with G protein-αi and caveolin I
        Steroids Volume 77, Issue 5, April 2012, Pages 424–432
    8.  Na/H exchanger regulatory factors control parathyroid hormone receptor signaling by facilitating differential activation of G(alpha) protein subunits
        J Biol Chem. 2010 Aug 27;285(35):26976-86
    9.  Beta-arrestin- but not G protein-mediated signaling by the "decoy" receptor CXCR7
        Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jan 12;107(2):628-32
    10.  Structural basis for activation of trimeric Gi proteins by multiple growth factor receptors via GIV/Girdin
        Mol Biol Cell. 2014 Nov 5;25(22):3654-71
    11.  Canonical and Non-canonical G-protein Signaling Helps Coordinate Actin Dynamics to Promote Macrophage Phagocytosis of Zymosan
        Mol Cell Biol. 2014 Nov 15;34(22):4186-99
    12.  Fatty Acid-binding Protein 5 (FABP5) Regulates Cognitive Function Both by Decreasing Anandamide Levels and by Activating the Nuclear Receptor Peroxisome Proliferator-activated Receptor β/δ (PPARβ/δ) in the Brain
    J Biol Chem. 2014 May 2;289(18):12748-58

     

     

     

  • 示例結(jié)果

     

    下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Gα13活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

     

     

              image.png

     

    Gα13活性分析

     

    MEF細(xì)胞用LPA處理 (lane 2) 或 不用LPA處理(lane 1)用抗活性的Gα13進(jìn)行免疫沉淀(Cat.No.26902).用anti-Gα13 rabbit polyclonal antibody(Cat.No. 21005). 做免疫印跡分析。

     底部圖片;上圖細(xì)胞裂解液的5%用anti-Gα13 rabbit polyclonal antibody(Cat.No. 21005).做免疫印跡,作為一個參照。

     

手機(jī)商鋪
資訊熱線

18062798497

(微信同步)

工作日9:00-18:00

在線留言

友情鏈接:

Copyright?2019武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司版權(quán)所有   備案號:鄂ICP備13003341號-2   公安備案號42018502003460

技術(shù)支持:優(yōu)狐