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PRODUCT CENTER
價格 | ¥6800.00 |
品牌 | NewEast Biosciences |
產(chǎn)地 | 中國 武漢 |
貨號 | 80301 |
規(guī)格 | 30 Assays |
說明書 | 說明書下載 |
Gαi Pulldown Assay Kit
Catalog Number: 80301
30 assays
產(chǎn)品說明
光子到大肽,結(jié)構(gòu)多樣化的配體激活G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的生理功能。配體結(jié)合的GPCRs作為鳥嘌呤核苷酸交換因子,在Gβγ存在的情況下,催化Gα亞基上的GDP與GTP交換,導致Gα亞基從Gβγ二聚體解離,形成兩個功能單元(Gα和Gβγ)。Gα和Gβγ亞基都向各種細胞信號轉(zhuǎn)導通路。根據(jù)序列和功能同源性,G蛋白可分為4個家族:Gs、Gi、Gq和G12。Gαi家族(包括Gαz)是G蛋白中最大的家族。它們傳遞GPCRs的信號來調(diào)節(jié)各種生物功能。目前還沒有直接的方法來測量受體對Gαi蛋白的激活(直到這個試劑盒)。大多數(shù)報告使用下游途徑之一,即腺苷酸環(huán)化酶的抑制作為讀數(shù)。
而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的 Gαi活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構(gòu)象的Gαi GTP 結(jié)合蛋白,而不識別Gαi GDP結(jié)合蛋白,進而簡單并且快速的進行Gαi 的活性檢測。同時試劑盒中的Gαi GTP 單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中Gαi的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進行 30 次檢測。
檢測原理
武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Gαi 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構(gòu)象的Gαi GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的(樣品需要進行 GTPγS 活化處理)活性Gαi GTP 的水平。簡言之,特異性識別Gαi 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細胞裂解液中的Gαi GTP 活性蛋白,然后利用 Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來,再利用識別Gαi的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。
試劑盒組份及保存
試劑盒所需自備物品
1. 刺激和未刺激的細胞裂解物;
2. 蛋白酶抑制劑;
3. 4 °C 搖桿或者搖床;
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0);
5. 1 M MgCl2;
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer;
7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑;
8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20);
9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA);
10 ECL 檢測試劑;
實驗操作步驟
A 試劑制備
1X Assay/Lysis Buffer:實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液,并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin(亮肽素),或 10 µg/mLaprotinin(抑肽酶)。
B 樣品處理
貼壁細胞
1. 培養(yǎng)細胞密度達到大約 80%-90%之間(直徑 10 cm 培養(yǎng)皿,~107個細胞),并用活性劑或抑制劑進行處理。
2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
3. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液(每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL)。
4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。
5. 用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。
6. 將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解,細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時,將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次,以破壞基因 組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清(~1-2 mg 總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
懸浮細胞
1. 培養(yǎng)細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。
2. 計數(shù)細胞后離心。
3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
4. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液(每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL)。
5. 反復吹打細胞進行裂解。
6. 將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解,細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時,
將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次,以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清(~1-2 mg 總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選)
注意:在細胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的Gαi被激活,而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的Gαi被激活。
1. 準備兩個離心管,每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物(如果是純的Gαi蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug)。
2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。
3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS(終濃度即為 100 uM)作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP(終濃度即為 1 mM)作為陰性對照。
4. 將離心管置于 30°C 條件下反應 30 min 并不斷攪動。
5. 終止反應:將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。
D. 激活Gαi的親和沉淀
1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。
2. 用 1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的總體積調(diào)整到1ml
3. 向管中加入 1ul 的活性Gαi 單克隆抗體。(Cat.# 26907)
4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻,
5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。
6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時,并輕輕的進行搖動。
7. 5000g,離心 1 分鐘。
8. 棄上清,這一步要非常小心以避免珠子的損失。
9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次,離心并棄去上清。
10. 最后一次洗滌后,小心的移去所有的上清。
11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。
12. 樣品煮沸 5min。
13. 5000g,離心 10s。
E. 蛋白印跡實驗
1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。
2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。
3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。
4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s,然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意:如果使用的是硝化纖維 素膜,此步省略。
5. 封閉; 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉,并需要恒定振蕩。
6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
7. 孵育一抗:用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Gαi PAb(Cat.# 21006),稀釋比例為 1:50-1:1000,主要根據(jù)樣品中含有的Gαi蛋 白的量)室溫下孵育 1-2 小時,或者 4°C 條件下過夜孵育.
8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
9. 孵育二抗:(例如羊抗兔 IgG-HRP)用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用,室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。
10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。
示例結(jié)果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Gαi活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考
Gαi活性分析
圖 A:CHO細胞轉(zhuǎn)染的野生型Gαi,用 GDP處理(lane 1)和用GTPγS處理(lane 2)以及活化的Gαi-Q204L (lane 3)用抗活性的Gαi單克隆抗體(Cat.No.26901)免疫親和沉淀,用anti- Gαi mouse monoclnal antibody (Cat.No 26003). 做免疫印跡分析。(top panel)
底部為細胞裂解液用anti- Gαi mouse monoclnal antibody (Cat.No 26003).做免疫印跡,作為參照。
圖 B: 表達人源的m2 mA ChR HEK293細胞用carbachol處理(lane 2)和不用carbachol處理(lane 2)用抗活性的Gαi單克隆抗體(Cat.No.26901)免疫親和沉淀,用Anti-Gαi PAb (Cat.No.21006).做免疫印跡分析(top panel)
底部為細胞裂解液用anti-tubulin 做免疫印跡,作為參照。
Related Products | |||
Catalog# | Name | Size | Price |
80301 | Gαi Activation Assay Kit | 30 assays | ¥6800 |
26901 | Active Gαi-GTP Monoclonal Antibody | 30 μL | ¥4800 |
26003 | Anti-Gαi Mouse Monoclonal Antibody | 100 μL | ¥2800 |
21006 | Anti-Gαi Rabbit Polyclonal Antibody | 100 μL | ¥2600 |
示例結(jié)果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Gαi活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考
Gαi活性分析
圖 A:CHO細胞轉(zhuǎn)染的野生型Gαi,用 GDP處理(lane 1)和用GTPγS處理(lane 2)以及活化的Gαi-Q204L (lane 3)用抗活性的Gαi單克隆抗體(Cat.No.26901)免疫親和沉淀,用anti- Gαi mouse monoclnal antibody (Cat.No 26003). 做免疫印跡分析。(top panel)
底部為細胞裂解液用anti- Gαi mouse monoclnal antibody (Cat.No 26003).做免疫印跡,作為參照。
圖 B: 表達人源的m2 mA ChR HEK293細胞用carbachol處理(lane 2)和不用carbachol處理(lane 2)用抗活性的Gαi單克隆抗體(Cat.No.26901)免疫親和沉淀,用Anti-Gαi PAb (Cat.No.21006).做免疫印跡分析(top panel)
底部為細胞裂解液用anti-tubulin 做免疫印跡,作為參照。
發(fā)表時間:2018年
名稱/貨號:Anti- Active Gαi Mouse Monoclonal Antibody / 26901
影響因子:Sci Signal IF=7.3
應用范圍:IP
種屬:Human
發(fā)表時間:2019年
名稱/貨號:Anti- Active Gαi Mouse Monoclonal Antibody /26901
影響因子:J Cell Sci IF=4
應用范圍:IP
種屬:Human Mouse
發(fā)表時間:2019年
名稱/貨號:Anti- Active Gαi Mouse Monoclonal Antibody / 26901
影響因子:J Exp Med IF=15.3
應用范圍:IP
種屬:Mouse
發(fā)表時間:2020年
名稱/貨號:Anti- Active Gαi Mouse Monoclonal Antibody /26901
影響因子:J Cell Biol IF=7.8
應用范圍:IHC
種屬:Mouse
發(fā)表時間:2020年
名稱/貨號:Anti- Active Gαi Mouse Monoclonal Antibody /26901
影響因子:Elife IF=7.7
應用范圍:IP
種屬:Human
發(fā)表時間:2020年
名稱/貨號:Anti- Active Gαi Mouse Monoclonal Antibody /26901
影響因子:Cancers (Basel) IF=5.2
應用范圍:IP
種屬:Human
發(fā)表時間:2021年
名稱/貨號:Gαi Pulldown Activation Assay Kit /80301
影響因子:J Endocrinol IF=4
應用范圍:IP-WB
種屬:Human
技術(shù)支持:優(yōu)狐