AAAAA少妇高潮大片,亚洲午夜无码久久久久,色综合99久久久无码国产精品,久久久精品国产免大香伊

武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司歡迎您!

手機(jī)店鋪

neweastbio@126.com

logo

 | 027-87561033

產(chǎn)品中心

PRODUCT CENTER

Gαs Pulldown Activation Assay Kit

價(jià)格¥6800.00
品牌NewEast Biosciences    
產(chǎn)地中國 武漢
貨號(hào)80801
規(guī)格30 Assays
說明書說明書下載
  • 產(chǎn)品描述
  • 產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)圖文
  • 通路和蛋白
  • 技術(shù)資料
  • 文獻(xiàn)引用
掃一掃購買
  • Gαs   Pulldown Activation Assay  Kit

    Catalog Number80801
    30 assays

     

    產(chǎn)品說明

     

        光子到大肽,結(jié)構(gòu)多樣化的配體激活G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)誘導(dǎo)其生理功能。配體結(jié)合的GPCRs的功能是鳥嘌呤核苷酸交換因子催化GDP與Gα亞基的交換GTP在Gβγ存在下,引起Gα亞基從Gβγ二聚體解離而形成兩個(gè)功能單位(Gα和Gβγ)Gα和Gβγ亞基都向各種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。根據(jù)序列和功能同源性,G蛋白可分為4個(gè)家族:Gas,Gi, Gq,和G12。Gs家族傳遞GPCRs的信號(hào),調(diào)節(jié)GPCRs的多種生物學(xué)功能腺苷酸環(huán)化酶的刺激。目前尚無直接測(cè)定Gαs活性的方法蛋白質(zhì)通過受體(直到這個(gè)試劑盒)。大多數(shù)報(bào)告使用了一種下游途徑,即增加作為一個(gè)讀數(shù)。

     

       而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的Gαs活性檢測(cè)試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識(shí)別特殊構(gòu)象的Gαs GTP 結(jié)合蛋白,而不識(shí)別Gαs GDP 結(jié)合蛋白,進(jìn)而簡單并且快速的進(jìn)行Gαs的活性檢測(cè)。同時(shí)試劑盒中的Gαs GTP 單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中Gαs的活性監(jiān)測(cè)。每套試劑盒可以進(jìn)行 30 次檢測(cè)。

     

     

    檢測(cè)原理

     

     

    武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Gαs 活性檢測(cè)試劑盒主要是利用識(shí)別蛋白特異構(gòu)象的Gαs GTP 單克隆抗體特異性的去檢測(cè)細(xì)胞提取物或者體外的(樣品需要進(jìn)行 GTPγS 活化處理)活性Gαs GTP 的水平。簡言之,特異性識(shí)別Gαs 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的Gαs GTP 活性蛋白,然后利用 Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來,再利用識(shí)別 Gαs的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測(cè)。

     

     

    試劑盒組份及保存

    image.png

     

     

    試劑盒所需自備物品

     

    1. 刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物;

    2. 蛋白酶抑制劑;

    3. 4 °C 搖桿或者搖床;

    4. 0.5 M EDTA (pH 8.0);

    5. 1 M MgCl2;

    6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer;

    7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑;

    8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20);

    9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA);

    10 ECL 檢測(cè)試劑;

     

      實(shí)驗(yàn)操作步驟

     

    A  試劑制備

    1X Assay/Lysis Buffer:實(shí)驗(yàn)前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液,并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin(亮肽素),或 10 µg/mLaprotinin(抑肽酶)。 

     

    B  樣品處理

      貼壁細(xì)胞

    1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間(直徑 10 cm 培養(yǎng)皿,~107個(gè)細(xì)胞),并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理。

    2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

    3. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液(每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL)。

    4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

    5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

    6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

    7. 如果核發(fā)生裂解,細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí),將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次,以破壞基因    組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。

    8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

    9. 收集上清(~1-2 mg 總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

     

    懸浮細(xì)胞

    1. 培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。

    2. 計(jì)數(shù)細(xì)胞后離心。

    3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

    4. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液(每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL)。

    5. 反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。

    6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

    7. 如果核發(fā)生裂解,細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí),

      將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次,以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

    8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

    9. 收集上清(~1-2 mg 總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

     

    C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對(duì)照(可選)

     

    注意:在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10% 的 Gαs 被激活,而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Gαs 被激活。 

     

    1. 準(zhǔn)備兩個(gè)離心管,每個(gè)管中各加入 0.5 mL 的細(xì)胞提取物(如果是純的 Gαs 蛋白則每個(gè)管中加入的蛋白量為 1ug)。

    2. 每個(gè)管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

    3. 一個(gè)管中加入 5ul 的 100X GTPγS(終濃度即為 100 uM)作為陽性對(duì)照。另一個(gè)管中加入 5ul 的 100X GDP(終濃度即為 1 mM)作為陰性對(duì)照。

    4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動(dòng)。

    5. 終止反應(yīng):將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

     

    D. 激活Gαs的親和沉淀

    1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

    2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個(gè)樣品的總體積調(diào)整到1ml

    3. 向管中加入 1ul 的活性 Gαs 單克隆抗體。(Cat.# 26906)

    4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻,

    5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

    6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時(shí),并輕輕的進(jìn)行搖動(dòng)。

    7. 5000g,離心 1 分鐘。

    8. 棄上清,這一步要非常小心以避免珠子的損失。

    9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次,離心并棄去上清。

    10. 最后一次洗滌后,小心的移去所有的上清。

    11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

    12. 樣品煮沸 5min。 

    13. 5000g,離心 10s。

     

    E. 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 

    1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

    2. 按照制造商的說明進(jìn)行 SDS-PAGE。

    3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

    4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s,然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意:如果使用的是硝化纖維 素膜,此步省略。 

    5. 封閉; 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時(shí)進(jìn)行封閉,并需要恒定振蕩。 

    6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

    7. 孵育一抗:用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Gαs PAb(Cat.# 21007),稀釋比例為 1:50-1:1000,主要根據(jù)樣品中含有的  Gαs 蛋 白的量)室溫下孵育 1-2 小時(shí),或者 4°C 條件下過夜孵育.

    8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

    9. 孵育二抗:(例如羊抗兔 IgG-HRP)用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用,室溫下孵育 1 小時(shí)并恒定振蕩。

    10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

    11. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測(cè)方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。

     

    示例結(jié)果

     

    下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Gαs活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考

     

                  image.png 

     

    Gαs活性分析

     

      純化的Gαs蛋白用GDP處理(lane 2)或GTPγS (lane 3)用抗活性的Gαs進(jìn)行免疫沉淀(Cat. No. 26906).用Anti-Gαs MAb(Cat. No. 26006). 做免疫印跡分析。

      純化的Gαs蛋白(lane 1)Anti-Gαs MAb(Cat. No. 26006).做免疫印跡,作為一個(gè)參照。 

     

    Related Products
    Catalog# Name Size Price
    80801 s Activation Assay Kit  30 assays  ¥6800
    26906 Active Gαs-GTP Monoclonal Antibody  30 μL  ¥4800
    26006 Anti Gαs Mouse Monoclonal Antibody  100 μL  ¥2800
    21007 Anti Gαs Rabbit Polyclonal Antibody  100 μL  ¥2600 

     

     

    Publications:
    1.  Glucocorticoid acts on a putative G protein-coupled receptor to rapidly regulate the activity of NMDA receptors in hippocampal neurons
        Am J Physiol Endocrinol Metab. 2012 Apr 1;302(7):E747-58
    2.  CRH activation of different signaling pathways results in differential calcium signaling in human pregnant myometrium before and during labor
        J Clin Endocrinol Metab. 2012 Oct;97(10):E1851-61
    3.  Estrogenic action on arterial smooth muscle: permissive for maintenance of CRHR2 expression
        Endocrinology. 2012 Apr;153(4):1915-24
    4.  Corticotropin-releasing hormone stimulates mitotic kinesin-like protein 1 expression via a PLC/PKC-dependent signaling pathway in hippocampal neurons
        Mol Cell Endocrinol. 2012 Oct 15;362(1-2):157-64
    5.   Rapid actions of xenoestrogens disrupt normal estrogenic signaling
         Steroids Volume 81, March 2014, Pages 36–42
    6.   Neuronal NF1/RAS regulation of cyclic AMP requires atypical PKC activation
         Hum. Mol. Genet. (2014)

     

  • 示例結(jié)果

     

    下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Gαs活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考

     

                  image.png 

     

    Gαs活性分析

     

      純化的Gαs蛋白用GDP處理(lane 2)或GTPγS (lane 3)用抗活性的Gαs進(jìn)行免疫沉淀(Cat. No. 26906).用Anti-Gαs MAb(Cat. No. 26006). 做免疫印跡分析。

      純化的Gαs蛋白(lane 1)用Anti-Gαs MAb(Cat. No. 26006).做免疫印跡,作為一個(gè)參照。

     

手機(jī)商鋪
資訊熱線

18062798497

(微信同步)

工作日9:00-18:00

在線留言

友情鏈接:

Copyright?2019武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司版權(quán)所有   備案號(hào):鄂ICP備13003341號(hào)-2   公安備案號(hào)42018502003460

技術(shù)支持:優(yōu)狐