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RalA  Pulldown Activation  Assay  Kit

Catalog Number：83601

30 assays

 

產(chǎn)品說明

 

   小GTPases是細胞信號調(diào)節(jié)因子的一個超級家族。Ras樣小G蛋白RalA/B是Ras信號通路的重要組成部分，參與了致瘤轉(zhuǎn)化的起始和維持，以及囊泡運輸、凋亡、轉(zhuǎn)錄、細胞遷移和細胞增殖。目前還沒有直接測定Ral GTPases活性的方法。

   

   武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的RalA活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構(gòu)象的Ral-GTP結(jié)合蛋白，而不識別Ral-GDP結(jié)合蛋白，進而簡單并且快速的進行RalA的活性檢測。同時試劑盒中的Ral-GTP單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中Ral的活性監(jiān)測。

 

 

檢測原理

    

     武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RalA 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構(gòu)象的RalA- GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行 GTPγS 活化處理）活性 RalA GTP 的水平。簡言之，特異性識別 RalA 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細胞裂解液中的 RalA GTP 活性蛋白，然后利用 Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再利用識別 RalA的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。

  

 

試劑盒組份及保存

 

試劑盒所需自備物品

 

1. 刺激和未刺激的細胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測試劑；

 

實驗操作步驟

 

A  試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B  樣品處理

  貼壁細胞

1. 培養(yǎng)細胞密度達到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制劑進行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5. 用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6. 將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因    組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

懸浮細胞

1. 培養(yǎng)細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。

2. 計數(shù)細胞后離心。

3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

5. 反復吹打細胞進行裂解。

6. 將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，

  將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）

 

注意：在細胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10% 的RalA 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 RalA被激活。 

 

1. 準備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物（如果是純的RalA蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應 30 min 并不斷攪動。

5. 終止反應：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D. 激活Ral的親和沉淀

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。

2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的體積調(diào)整到1ml

3. 向管中加入 1ul 的活性 Ral單克隆抗體。(Cat.# 26913)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進行搖動。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實驗 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-RalA PAb(Cat.# 21034),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 RalA 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。

 

示例結(jié)果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RalA 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

 

RalA 活性分析 

  純化的GST-RalA蛋白 用GDP處理 (lane 3) 或 GTPγS (lane 2).用 GST-RalA protein (lane 1) 做為對照。用用抗活性的Ral進行免疫沉淀(Cat. No. 26913).用 anti RalA rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21034). 做免疫印跡分析。

 

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示例結(jié)果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RalA 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

 

       

 

RalA激活試驗； 純化的GST-RalA蛋白 用GDP處理 (lane 3) 或 GTPγS (lane 2).用 GST-RalA protein (lane 1) 做為對照。用用抗活性的Ral進行免疫沉淀(Cat. No. 26913).用 anti RalA rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21034). 做免疫印跡分析。